Fyrkantig johannesört växer på något kalkfattig och mullrik mark. Den är vanlig i glesare löv- eller blandskogar där den hittas i bryn, gläntor och längs skogsvägar. Fyrkantig johannesört undviker hårdbetade lokaler men ses i samtliga av de få slåtterängar som ännu finns på Öland. Arten växer ibland i åkerkanter men är sällsynt som ruderatväxt.

Fyrkantig johannesört är vanlig inom Mittlandet och den västra kustskogen, från Räpplinge sn i norr till Vickleby i söder. På det skogfattiga sydöstra Öland finns få observationer. Växten saknas på Stora Alvaret frånsett några enstaka fynd från traktorvägar i kanten av skogsdungar. Troligen är alvarlokaler alltför kalkrika och näringsfattiga för att passa växten. I de fyra nordligaste socknarna ligger fynden tätt där arten växer i skogsbryn, gläntor och åkerrenar. Fyrkantig johannesört förefaller ha en tydlig minskning sedan Sterner (1938); troligen har den missgynnats av de förluster som skett av trädbärande slåtterängar och minskat skogsbete.

Fyrkantig johannesört känns igen på att stjälken har fyra lister, foderbladen är breda och trubbiga, kronbladens kant saknar glandler mot spetsen. Äkta johannesört H. perforatum har stjälk med två lister, foderbladen är smala och spetsiga, kronbladens spets har mörka glandler.

Gammal, bofast.