Fyrkantig johannesört växer oftast på frisk till fuktig, öppen mark, t.ex. i naturbetesmarker och fuktängar. Den var förr en framträdande art i slåtterängarna. Lika vanlig är växten i frisk, gles löv- eller blandskog, i bryn, på åker- och dikesrenar samt på vägkanter. Den påträffas ibland även i torrängar. Arten är konkurrenskraftig och gynnas starkt vid upphörd hävd: i svagt betad hagmark och på igenlagda åkrar kan den bilda massförekomster.