Timotej föredrar torr till frisk, näringsrik mark och förekommer i alla slags kulturpräglade miljöer, särskilt vägkanter och åkerrenar, gårdsområden, övergivna åkrar och kulturbetesmarker. Flera uppgifter från tidigt 1800-tal antyder att gräset då även förekom som ett inslag i naturlig ängsmark. Men timotej är också ett av våra äldsta vallgräs, odlat från utländskt frö sedan senare hälften av 1700-talet, och det är nu ogörligt att skilja mera ursprungliga bestånd från odlade och förvildade. En mycket stor del av dagens timotejförekomster torde dock ha sitt ursprung i odling.

Timotej gynnas starkt av den allmänna igenväxningen och kväveberikningen.