Tvåblad växer i friskare skogar, gärna med en viss kalkpåverkan. Den ses i ädellövskogar, hässlen, trivialare lövskogar, diverse busk- och igenväxningsmark samt någon gång i rikare gran- eller tallskogar. Tvåblad undviker magra och torra barrskogar. Orkidén växer även öppet på betade alvartorrängar, i slåtterängar, tuviga kalkfuktängar och kanten av skogskärr. Tvåblad gynnas av viss störning och ses i större antal efter röjningar av betesmarker. Den är inte främmande för miljöer som vägkanter, gamla sandtag och trädesåkrar. Vid ett tillfälle är den funnen i karstmiljö.

Tvåblad är vanlig och spridd över större delen av Öland men speciellt frekvent inom de lövskogsklädda delarna av Mittlandet. Den är sparsam på det skogfattiga sydöstra Öland, Stora Alvaret samt de magra barrskogarna längst uppe i norr. Tvåblad har till viss del gynnats av den förbuskning som skett av landskapet.

Gammal, bofast.