Fyrkantig johannesört är ursprunglig men mycket kulturgynnad. I naturliga miljöer som sluttningar och branter med gles lövskog, gärna bergekskog, växer den oftast sparsamt. Arten är emellertid mycket vanligare på torr till frisk kulturmark där den kan växa i mindre grupper eller ganska täta bestånd. Vanliga växtplatser är naturbetesmarker, övergivna åkrar, gläntor, bryn, skogsvägar, åker- och vägrenar, vägslänter och dikesrenar samt gräsdominerad ruderatmark. På övergiven åkermark kan den ibland uppträda mycket rikligt.