Tvåblad är en flerårig orkidé med kort jordstam och utan näringslagrande knölar. Arten är starkt kalkgynnad och normalt en pålitlig kalkindikator. Den växer både öppet och i tät skog. Växten föredrar mull- och lerrik jord på ganska blockfri mark. De flesta lokaler är något fuktiga och arten förekommer särskilt ymnigt i utströmningsområden med kalkrikt rörligt grundvatten. Många växtplatser ligger i myrkanter men arten växer också i fastmattor i halvöppna rikkärr och backkärr. Tvåblad förekommer i fuktiga lövlundar och även i gamla parker liksom i örtrik granskog och i många andra skogstyper. Skogen tycks dock ha liten betydelse – det är istället mark och fuktighetsförhållanden som är avgörande för artens trivsel. Tvåblad växer även på öppen skogsmark liksom på fuktig ängsmark. Arten är beteskänslig men förekom förr i örtrika slåtterängar. Den ses ibland i vägdiken och längs igenväxande kalkrika skogsvägar men växt-en är i övrigt inte särskilt kulturgynnad och trivs inte alls på näringsbelastade skräpmarker.