Tvåblad har liknande utbredning som den grönvita nattviolen. Tvåblad växer i lundar och örtrika granskogar, särskilt på genomsilad mark, i lövsnårsbryn, och ofta i kalkkärrens kantvegetation. Under ängsslåtterns tid var tvåblad vidare spritt, men har gått tillbaka utom i kalktrakter.