Jungfru Marie nycklar växer mest i fuktig skogsmark, både ängsskog och hedskog, särskilt kring skogskärr och i bäckdråg, i regel fåtalig. Ibland växer den också ute på myrarnas tuvor och fastmattor. Arten förekommer också ofta som kolonisatör på bar mineraljord i nyanlagda skogsvägsdiken. Den är slåttergynnad och betesgynnad, men känslig för intensivt bete. Någon gång förekommer den i praktfulla, skyddsvärda massförekomster i fuktiga, svagt betade hagmarker, exempelvis vid Väsby i Vårdinge och på Sundbykullen intill Malmköping. Arten har minskat betydligt under 1900-talet på grund av igenväxning efter minskad hävd. Blomningen varierar starkt mellan olika år. Vissa år är den knappt synlig, andra år visar den sig nästan överallt.