Europa, Asien, Nordamerika, norra Afrika, Australien. I Sverige upp till Västerbotten, men sällsynt norrut. I Sörmland allmän, något ovanligare längst i väster – (88%). Äkta johannesört växer på sandiga jordar samt i bergs- och klippterräng, även långt ute i skärgården. Arten är värmefordrande och växer helst i soliga lägen. Den tycks något beteskänslig och växer vanligen på refugier som blockmarker och klippavsatser i betesmarker, där den får skydd och dess behov av ljus tillgodoses. Arten är också allmän i vägkanter och på järnvägsbankar. I äldre tid förekom den främst i slåtterängar. Även om johannesörten av kartbilden att döma tycks jämnt spridd i Sörmland varierar frekvensen på lokalplanet väsentligt. I östra delen av landskapet är arten allmän i rutorna medan den i väster oftast endast finns i enstaka bestånd.