Nattviolen växer på klippängar vid havet, i öppna, tidigare betade örtrika skogar, i ängsfragment, i skogsbryn och i ogödslade beteshagar. Arten är slåtter- och betesgynnad, men inte kalkberoende. Arten har minskat under 1900-talet i samband med igenväxning efter upphörande slåtter och bete. En storvuxen form av nattviol brukar kallas skogsnattviol – P. bifolia subsp. latifolia. Det är oklart vilken status den egentligen bör ha. I Sörmland tycks den vara sällsynt och främst finnas i kusttrakternas lundområden. På Ramsholmen i Sorunda förekommer den rikligt i igenväxande lövängar och det är väl särskilt i kustens kalkrika lundmiljöer den bör sökas.

Hybriden mellan nattviol och grönvit nattviol P. chlorantha förekommer någon gång där föräldraarterna växer tillsammans.