Äkta johannesört är troligen ursprunglig i naturlig klippängsvegetation i skärgården. I Gävletraktens växter 1863 anges arten förekomma »flerstädes på kusten«. Betydligt fler inlandsfynd än tidigare är nu kända. Uppenbarligen har arten fått ökad spridning inåt landet under 1900-talet.
Utanför kusten är arten starkt knuten till banvallar och stationsområden längs järnvägsnätet, vilket sannolikt beror på att den här ingått i gräsfröinsåningar eller följt med grusfyllningen. Från järnvägen har den även spritt sig till större industriområ-den. Mer sällan och slumpmässigt uppträder den äkta johannesörten även i grustag, längs vägar och kring odlad mark. Arten blommar under senare delen av sommaren. Den bildar frön i kapslar som mognar under hösten. Den huvudsakliga fröspridningen torde därmed ske vintertid. Arten har en kraftig pålrot men saknar utlöpare och vegetativ spridningsförmåga.
Vanligaste följearterna är röllika (29%), gulmåra, renfana och smultron.