Nattviol växer öppet eller i halvskugga på frisk gräsmark i naturbeten, hagmarker och glesa löv- och blandskogar, oftast i gläntor och bryn. Man finner den också tillsammans med jungfru Marie nycklar i fuktängar, dråg och småkärr i kustlandets hällmarker. Arten gynnas av brand och kan tillfälligt slå upp i stor mängd efter bränning av gräsmarker eller hedar.